Samoloty D.XXI znalazły się na wyposażeniu trzech dywizjonów myśliwskich: 1 Dywizjonu (1. JaVA) bazującego na lotnisku De Kooy, 2 Dywizjonu (2. JaVA) bazującego na lotnisku Schiphol i 5 Dywizjonu (5. JaVA) bazującego na lotnisku Ypenburg.

Już we wrześniu 1939 roku samoloty te zestrzeliły pierwszy niemiecki samolot Junkers Ju 88, który naruszył przestrzeń powietrzną Holandii. Później jeszcze kilkakrotnie walczyły z samolotami niemieckimi jak również brytyjskimi, które przekroczyły granice holenderskie.

W momencie ataku wojsk niemieckich na Holandię, w lotnictwie holenderskim znajdowało się 32 samoloty tego typu, z tego 29 sprawnych. Wzięły one udział w walkach z samolotami Luftwaffe, w trakcie których uzyskano 16 zwycięstw oraz 17 prawdopodobnie. Zniszczonych 20 samolotów.

Kilka z samolotów dostało się w ręce Niemców i przynajmniej jeden samolot tego typu (numer boczny 215) otrzymał niemieckie znaki rozpoznawcze i był testowany przez Luftwaffe. Później przekazano go do berlińskiego Muzeum Lotnictwa, gdzie był eksponowany nieopodal polskiego PZL P.11. Egzemplarz ten najprawdopodobniej został zniszczony podczas bombardowania Muzeum w 1943 roku.